纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，也是全球最豐富的可再生碳水化合物。由于其獨(dú)特的物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是“鎖起來(lái)的能量庫(kù)”，“難啃的硬骨頭”。食用菌生產(chǎn)可將農(nóng)作物秸稈、畜禽糞便和園林廢棄枝條等轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)蛋白與健康食品，直接“變草為寶、點(diǎn)糞成金”。靈芝作為基因組中水解酶數(shù)量最多的食用菌之一，通過(guò)產(chǎn)生大量的纖維素酶來(lái)降解纖維素。最新研究證實(shí)，靈芝纖維素酶可把玉米秸稈、玉米芯等農(nóng)業(yè)廢棄纖維素轉(zhuǎn)化為食用菌蛋白質(zhì)。這相當(dāng)于把“柴火”變成“瘦肉”，但靈芝如何利用纖維素的作用機(jī)制仍不清晰。
近日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)趙明文教授團(tuán)隊(duì)在微生物權(quán)威期刊mBio雜志上發(fā)表題為“GlSlt2 positively regulates GlMyb-mediated cellulose utilization in Ganoderma lucidum”的文章。該研究揭示了靈芝絲裂原活化蛋白激酶GlSlt2通過(guò)磷酸化修飾轉(zhuǎn)錄因子GlMyb促進(jìn)靈芝纖維素利用的作用機(jī)制。
具體結(jié)果：
一、GlSlt2提高靈芝纖維素酶活性。為了研究絲裂原活化蛋白激酶GlSlt2在靈芝纖維素利用中的作用，我們檢測(cè)了GlSlt2沉默菌株和GlSlt2過(guò)表達(dá)菌株中的纖維素酶活性。結(jié)果顯示Slt2沉默菌株顯著低于野生型的內(nèi)切纖維素酶活性（約降低55%）和外切葡聚糖酶活性（約降低58%）（圖1A和B）。Slt2過(guò)表達(dá)菌株中的內(nèi)切纖維素酶和外切葡聚糖酶活性分別提高了2.5倍和5倍（圖1D和E），但沉默和過(guò)表達(dá)菌株中β-葡萄糖苷酶活性沒(méi)有顯著差異（圖1C和1F）。說(shuō)明GlSlt2提高靈芝內(nèi)切和外切纖維素酶活性。
圖1
二、GlSlt2磷酸化修飾轉(zhuǎn)錄因子GlMyb。為了探究GlSlt2調(diào)控纖維素利用的分子機(jī)制，通過(guò)酵母雙雜交（Y2H）文庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)GlSlt2與R2R3型GlMyb轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。并通過(guò)Y2H實(shí)驗(yàn)、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）實(shí)驗(yàn)和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證（圖2）。GlSlt2作為蛋白激酶，能夠磷酸化修飾相互作用的蛋白。通過(guò)體內(nèi)、體外磷酸化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了GlSlt2對(duì)GlMyb的磷酸化，并找到了245位絲氨酸是磷酸化修飾的位點(diǎn)（圖3）。
圖2
圖3
三、磷酸化的GlMyb提高纖維素酶基因表達(dá)并激活纖維素酶活性。為了研究GlMyb調(diào)控纖維素酶活性的分子機(jī)制，通過(guò)酵母單雜交實(shí)驗(yàn)、EMSA和染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP-qPCR）驗(yàn)證了GlMyb可以與纖維素酶相關(guān)基因的啟動(dòng)子結(jié)合情況。發(fā)現(xiàn)第245位絲氨酸的磷酸化增強(qiáng)GlMyb與纖維素酶基因（CBH1、CBH3、EG1、EG3和EG5）啟動(dòng)子的結(jié)合能力（圖4）。進(jìn)一步采用了RNAi技術(shù)篩選了GlSlt2-GlMyb的雙沉默菌株（Slt2i-Mybi-2和Slt2i-Mybi-3），并測(cè)定了內(nèi)切纖維素酶和外切葡聚糖酶的活性。酶學(xué)測(cè)定表明，與GlSlt2單沉默菌株相比，GlSlt2-GlMyb雙沉默菌株的內(nèi)切纖維素酶和外切葡聚糖酶活性顯著降低，其水平與GlMyb單沉默菌株中觀察到的酶活相似（圖5）。說(shuō)明磷酸化的GlMyb提高纖維素酶基因表達(dá)并激活纖維素酶活性。
圖4
圖5
結(jié)論：在本項(xiàng)研究中探究了絲裂原活化蛋白激酶GlSlt2調(diào)控靈芝利用纖維素的作用機(jī)制，通過(guò)酵母雙雜交篩庫(kù)、雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GlSlt2能夠與R2R3型Myb轉(zhuǎn)錄因子相互作用，并且GlSlt2磷酸化修飾GlMyb的第245位絲氨酸。進(jìn)一步通過(guò)酵母單雜交實(shí)驗(yàn)、EMSA和ChIP-qPCR證明GlMyb的245位絲氨酸磷酸化促進(jìn)其與多個(gè)纖維素酶相關(guān)基因啟動(dòng)子的結(jié)合（纖維二糖水解酶CBH1和CBH3、內(nèi)切葡聚糖酶EG1、EG3和EG5），并促進(jìn)纖維素酶基因表達(dá)。本研究揭示了靈芝纖維素利用的作用機(jī)制，這些結(jié)果為生物質(zhì)轉(zhuǎn)化和生物圈碳循環(huán)奠定了基礎(chǔ)。
