靈芝多糖的藥效學(xué)研究

Ⅰ．抗惡性腫瘤、抗血栓和抗凝血作用

陳建濟(jì) 吳志強(qiáng) 王秀敏 李克華 劉廣芬 王晴川 (福建醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所 350004)胡 恩 林志偉 楊 亮 王素香 林珉弘 (福建中醫(yī)學(xué)院中藥系實(shí)習(xí)生 350003)

摘要　本文用1．靈芝子實(shí)體經(jīng)水提、乙醇沉制得靈芝多糖（GLPS）精品，用苯酚-硫酸法測(cè)其百分含量。2．應(yīng)用小鼠移植性惡性腫瘤瘤株（S\-\{180\}、U\-\{14\}、EAC)，觀察GLPS對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響。3．觀察GLPS對(duì)小鼠全血凝血時(shí)間及出血時(shí)間和大鼠血栓及血液凝固系統(tǒng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1．用本方法提取GLPS得率為0．589±0．135％。2．GLPS 40 mg／(kg*d)．ig×17 d對(duì)小鼠肉瘤（S-180）和宮頸癌（U-14）的平均抑瘤率分別為43％和51％，而對(duì)艾氏腹水癌（EAC）小鼠生命沒(méi)有明顯延長(zhǎng)作用（P＞0．05）。3．GLPS 20 mg／(kg*d)．ig×10 d或20～40 mg*kg-1．iv均能明顯延長(zhǎng)小鼠的凝血時(shí)間和出血時(shí)間（P＜0．01)。GLPS 40 mg／(kg*d)．ig×10 d能明顯抑制大鼠的血栓形成（P＜0．01)，降低纖維蛋白原的含量（P＜0．01），同時(shí)能明顯延長(zhǎng)部分凝血活酶時(shí)間（KPTT）（P＜0．01）。說(shuō)明GLPS具有抗腫瘤、抗血栓和抗凝血的作用。

關(guān)鍵詞　靈芝多糖，抗腫瘤，抗血栓，抗凝血Studies on the Pharmacological Effects of the Polysaccharides of Ganoderma LucidumⅠ．Anticancer，Antithrombosis and anticoagulation of bloodChen Jianji，Wu Zhiqiang，et al （Fujian Medical University，Laboratory of Snake Venom Research　350004）Hu En,Lin Zhiwei et al (Fujian Colloege of Traditional Chinese Medicine 350003)Abstract Study on the anticancer activity and the effect on blood coagulation of Polysaccharides separated Ganoderma lucidum(ling zhi)was reported in this paper．Polysaccharide of Ganoderma lucidum（GLPS）was separated by water extraction and ethanol precipitation．The yield of GLPS separated from native drug was about 0．589±0．139％ by phenol-sulfuric acid method．a(chǎn)ssayed. The cancer cell line of S-180 and U-14 were implanted into the axillary subcutaneous of mice for studying the anticancer effect．It indicated that Glps GLPS 40 mg*kg-1．ig．d×17 d decreased the weight of cancer by about 43％（S-180） and 51％（U-14）．The clotting and bleeding time of mice blood were uses for observing the effect on coagulation．The antithrombotic effect was assayed on rats by thrombosis test ex vivo．GLPS 20 mg*kg-1．d ig×10 d and 20～40 mg*kg-1．iv into mice prolonged the blood clotting and bleeding time（P＜0．01）．a(chǎn)nd GLPS 40 mg*kg-1．d．ig×10 d into rats decreased thrombosis and fibrinogen level of blood plasma（P＜0．01），the kaolin partial thrombin time was prolonged（P＜0．01）．These can conclusion that the GLPS of Ganoderma lucidum possessed the anticancer，antithrombosis and anticoagulation effects．Key words Polysaccharide of Ganoderma lucidum，Anticancer，Antithrombosis，Anticoagulation

靈芝［赤芝，Ganoderma Lucidum（Leyys．ex Fr）Karst］為一種靈芝屬的真菌。中國(guó)歷代醫(yī)家視為滋補(bǔ)強(qiáng)壯，扶正固本，延年益壽之珍品 。靈芝多糖是靈芝的主要有效成分之一，具有多種的生理活性。本文主要對(duì)靈芝多糖抗腫瘤、抗血栓和抗凝血方面的作用進(jìn)行研究。1 材 料1．1 藥品與試劑　靈芝子實(shí)體購(gòu)自三明真菌研究所；5-氟尿嘧啶注射液（5-FU）為上海旭東海普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)971006；環(huán)磷酰胺（CPM）為上海華聯(lián)制藥公司產(chǎn)品，批號(hào)960102；凍干凝血酶、凝血活酶及部分凝血活酶均為上海醫(yī)大華山醫(yī)院技協(xié)試劑公司的產(chǎn)品，批號(hào)99035；纖維蛋白測(cè)定酸性緩沖液為寧波市慈城生化試劑廠生產(chǎn)，批號(hào)980819；5-腺苷二磷酸二鈉鹽（ADP）為上海伯奧生物科技有限公司產(chǎn)品。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1．2 動(dòng)物　昆明種小鼠體重為18～22 g，Wistar種大鼠體重為300±20 g ，雌雄兼用，均由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1．3 瘤株　小鼠肉瘤（S\-\{180\}）、宮頸癌（U\-\{14\}）及艾氏腹水癌（EAC）均自上海中國(guó)科學(xué)院藥物研究所引進(jìn)，在福建醫(yī)科大學(xué)蛇毒所傳代使用。1．4 儀器　多功能雙通道血液凝聚儀，電腦血漿纖維蛋白原測(cè)定儀，MR-4型多環(huán)血栓檢測(cè)儀均為上海高機(jī)應(yīng)用技術(shù)研究所產(chǎn)品；80-2型離心機(jī)為上海手術(shù)器械廠生產(chǎn)；7520型分光光度計(jì)為上海分析儀器廠生產(chǎn)；TG729C單盤(pán)電光分析天平為上海天平儀器廠生產(chǎn)。2 方法和結(jié)果2．1 靈芝多糖的提取及含量測(cè)定2．1．1 提取流程［1］

2．1．2 含量測(cè)定(2,3)　以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，配制不同濃度（10～80 μg*ml-1）的標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取1 ml標(biāo)準(zhǔn)液置于10 ml具塞比色管中，加入1 ml 5％苯酚和5 ml濃硫酸，搖勻反應(yīng)20 min，于487 nm處測(cè)其吸收值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸收值為縱坐標(biāo)，制取標(biāo)準(zhǔn)曲線并求其回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

管號(hào) 0 1 2 3 4 5 6

葡萄糖濃度（μg*ml-1） 0 10 20 40 50 60 80

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml） 0 1 1 1 1 1 1

5％苯酚（ml） 1 1 1 1 1 1 1

濃硫酸（ml） 5 5 5 5 5 5 5

A\-\{487 nm\} 0 0．175 0．262 0．427 0．519 0．648 0．795

稱取各批靈芝多糖粗品10 mg，配成0．1 mg*ml-1的水溶液作為供試液，各取1 ml依上法測(cè)其吸收值（5批GLPS粗品的A\-\{487 nm\}分別為0．697，0．682，0．670，0．656，0．671），代入回歸方程，求出靈芝多糖的含量及提取率，結(jié)果(見(jiàn)表2)。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y＝0．085＋0．0090x（r＝0．9978）表2 靈芝多糖粗品中靈芝多糖的含量及提取率

批號(hào) 1 2 3 4 5

靈芝子實(shí)體干重（g） 335 376 416 255 274

靈芝多糖粗品（g） 3．00 3．11 3．20 3．12 3．42

靈芝多糖含量（％） 68．0 66．3 65．0 63．4 65．1

靈芝多糖提取率（％） 0．609 0．548 0．500 0．476 0．813

2．2 靈芝多糖的抗腫瘤作用(4,5)2．2．1 靈芝多糖對(duì)實(shí)體型移植瘤小鼠瘤塊生長(zhǎng)的影響　每次實(shí)驗(yàn)用同一性別小鼠，隨機(jī)分為3組：生理鹽水（NS)組、靈芝多糖(GLPS))組和5-氟尿嘧啶（5-FU）組或環(huán)磷酰胺（CPM）組。GLPS組提前灌胃（ig）40 mg／(kg．d)1周后，給各組小鼠接種瘤塊。在無(wú)菌條件下，從荷瘤10～14 d、S180或U14瘤塊生長(zhǎng)良好的小鼠采取并切成直徑2 mm～3 mm的瘤塊，用套管針將其種入小鼠右側(cè)腋窩皮下。接種后GLPS組繼續(xù)給藥10 d，5-FU組腹腔注射（ip）5-FU 20 mg*kg-1 4次或CPM組ip CPM 50 mg*kg-1 2次，隔日一次，NS組ig同一體積的生理鹽水。于停藥后處死小鼠，剝下皮下瘤塊并稱重，按下式計(jì)算抑瘤率。靈芝多糖對(duì)小鼠S180和U14的平均抑瘤率分別為43％和51％，靈芝多糖組的平均瘤重明顯輕于NS組（P＜0．01)，結(jié)果(見(jiàn)表3及圖1和表4及圖2)。抑瘤率＝（1－(給藥組動(dòng)物平均瘤重)/(NS組動(dòng)物平均瘤重)）×100％表3 靈芝多糖灌胃對(duì)小鼠肉瘤（S180）生長(zhǎng)的影響（n＝10，X-±S）

　 藥物 劑量（mg／kg．d×d） 瘤重（g） 抑瘤率（％） P值

第一次 NS － 1．4±0．4 － －

　 GLPS 40×17 0．8±0．2 40 ＜0．01

　 5-FU 20×4 0．9±0．4 21 ＞0．05

第二次 NS － 2．4±0．9 － －

　 GLPS 40×17 1．2±0．7 47 ＜0．01

　 5-FU 20×4 1．8±0．6 24 ＞0．05

第三次 NS － 2．8±0．8 － －

　 GLPS 40×17 1．6±0．4 42 ＜0．01

　 CPM 50×2 0．2±0．2 93 ＜0．001

2．2．2 靈芝多糖對(duì)腹水型移植瘤的小鼠存活時(shí)間的影響　每次實(shí)驗(yàn)用同一性別 小鼠，隨機(jī)分為3組：（NS）組、靈芝多糖(GLPS)組和環(huán)磷酰胺(CPM)表4 靈芝多糖灌胃對(duì)小鼠宮頸癌（U14）生長(zhǎng)的影響（n＝10，X-±S）

　 藥物 劑量（mg／kg．d×d） 瘤重（g） 抑瘤率（％） P值

第一次 NS － 3．8±1．1 － －

　 GLPS 40×17 1．9±0．7 49 ＜0．01

　 5-FU 20×4 2．4±1．8 36 ＜0．01

第二次 NS － 3．8±1．0 － －

　 GLPS 40×17 2．4±0．9 40 ＜0．01

　 CPM 50×2 0．1±0．6 97 ＜0．001

第三次 NS － 4．0±0．9 － －

　 GLPS 40×17 2．3±0．9 44 ＜0．01

　 CPM 50×2 0．5±0．5 88 ＜0．001

第四次 NS - 3.6±1．0 － －

　 GLPSⅠ 40×17 1．8±0．5 50 ＜0．01

　 GLPSⅡ 80×17 1．7±0．4 52 ＜0．01

　 CPM 50×2 1．2±0．4 67 ＜0．01

圖1 靈芝多糖灌胃對(duì)小鼠肉瘤（S180）生長(zhǎng)的影響

圖2 靈芝多糖灌胃對(duì)小鼠宮頸瘤（U14）生長(zhǎng)的影響組。GLPS組提前灌胃（ig）40 mg／(kg．d)1周后。在無(wú)菌條件下，取接種7～8 d生長(zhǎng)良好的艾氏腹水癌（EAC）制成1∶4腫瘤細(xì)胞生理鹽水混懸液，給每只小鼠接種0．2 ml。接種后GLPS組繼續(xù)給藥10 d，CPM組ip CPM 50 mg*kg-1 2次，隔日1次，NS組ig同一體積的生理鹽水。于停藥后觀察每只小鼠的生存天數(shù)，按下式計(jì)算生命延長(zhǎng)率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，與NS組比較40 mg*kg-1的GLPS沒(méi)有明顯延長(zhǎng)小鼠的生命（P＞0．05），平均生命延長(zhǎng)率為15％，結(jié)果(見(jiàn)表5)。生命延長(zhǎng)率＝(給藥動(dòng)物平均存活天數(shù)／對(duì)照動(dòng)物平均存活天數(shù)－1)×100％表5 靈芝多糖灌胃對(duì)艾氏腹水癌（EAC）小鼠存活時(shí)間的影響（n＝10）

　 藥物 劑量（mg／kg．d×d） 　 小鼠生存天數(shù)X-±S 生命延長(zhǎng)率（％） P值

第一次 NS － 12．5±1．3 － －

　 GLP 40×17 13．9±0．7 11 ＞0．05

　 CPM 50×2 15．9±1．8 28 ＜0．01

第二次 NS － 11．8±1．5 － －

　 GLP 40×17 13．8±1．0 17 ＞0．05

　 CPM 50×2 15．1±2．9 27 ＜0．01

第三次 NS － 11．8±1．6 － －

　 GLP 40×17 13．9±1．7 18 ＞0．05

　 CPM 50×2 16．0±1．7 36 ＜0．01

2．3 靈芝多糖對(duì)小鼠全血凝血時(shí)間及出血時(shí)間的影響2．3．1 靈芝多糖對(duì)小鼠全血出血時(shí)間的影響(6)　取小鼠50只，隨機(jī)分為4組，GLPS組和一組NS組。GLPS組Ⅰ GLPS 20 mg／(kg．d)．ig×10 d。NS組ig同體積的生理鹽水。GLPS組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別GLPS 40、30、20 mg*kg-1．iv后1 h，用利剪將小鼠距尾尖3 mm處剪斷，待血自行溢出時(shí)開(kāi)始計(jì)量，每隔30 S用濾紙吸去血滴一次，直至血流停止(以濾紙吸至無(wú)血跡時(shí)為準(zhǔn))計(jì)算出血時(shí)間，所得數(shù)據(jù)與NS組進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果表明：靈芝多糖能明顯延長(zhǎng)小鼠的出血時(shí)間（P＜0．01），(見(jiàn)表6)。表6 靈芝多糖對(duì)小鼠凝血和出血時(shí)間的影響（n＝10，X-±S）

組別 藥物劑量及途徑（mg／kg．d） 出血時(shí)間(s） 凝血時(shí)間（s）

NS組 － 185±74 75±22

GLPS組Ⅰ 40×10．ig 872±46** 172±43**

GLPS組Ⅱ 40．iv 780±50** 116±27**

GLPS組Ⅲ 30．iv 720±40** 115±15**

GLPS組Ⅳ 20．iv 720±40** 108±14**

與NS組比較，**：P＜0．012．3．2 靈芝多糖對(duì)小鼠全血凝血時(shí)間的影響(7)　取測(cè)定出血時(shí)間的各組小鼠，用彎鑷迅速摘去一側(cè)眼球，于載玻片兩端各滴1滴直徑5 mm的血滴。立即用秒表記時(shí)，每隔一定時(shí)間用清潔針頭自血滴邊緣向里輕輕挑動(dòng)1次，觀察有無(wú)血絲挑起。從采血開(kāi)始至挑起血絲為止，所歷時(shí)間即為凝血時(shí)間。另取1滴血作為正常凝血情況判別對(duì)照。記錄各小鼠的凝血時(shí)間，進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果表明：靈芝多糖能顯著延長(zhǎng)小鼠的凝血時(shí)間（P＜0．01），(見(jiàn)表6)。2．4 靈芝多糖對(duì)大鼠血栓形成及血液凝固系統(tǒng)的影響。取大鼠20只，隨機(jī)分成NS組、GLPS組。GLPS組ig GLPS 40 mg／(kg．d)×10 d，NS組ig同體積的生理鹽水。給藥10 d后，用20％烏拉坦按\{0．5 ml*100 g-1體重ip麻醉后，打開(kāi)大鼠胸腔，暴露心臟采血3 ml，其中0．5 ml直接用MR-4型多環(huán)血栓測(cè)定儀測(cè)定血栓長(zhǎng)度和濕重（Chandler氏法)。另2．5 ml血加入0．3 ml（按9∶1）枸櫞酸鈉（3．8％）混勻，100 RPM離心5 min，吸取0．1 ml富血小板血漿（PRP)于特制的小試管中，用多功能雙通道血液凝聚儀測(cè)定血小板數(shù)目。再以3000 RPM離心10 min，吸取0．1 ml貧血小板血漿（PPP），加入相應(yīng)的酶試劑后，用多功能雙通道血液凝聚儀分別檢測(cè)凝血活酶時(shí)間（PT)、凝血酶時(shí)間(TT)、部分凝血活酶時(shí)間(KPTT)。另在小試管中加入2 ml纖維蛋白原酸性緩沖液和0．1 ml PPP，混勻，置入電腦血漿纖維蛋白原測(cè)定儀測(cè)定纖維蛋白原含量。結(jié)果表明：靈芝多糖能明顯減少大鼠血栓的長(zhǎng)度和濕度（P＜0．01），并降低纖維蛋白原含量（P＜0．01），明顯延長(zhǎng)KPTT時(shí)間（P＜0．01）(見(jiàn)圖3)。

圖3 靈芝多糖（40 mg／kg．d．ig×10 d）對(duì)大鼠血液凝固系統(tǒng)的影響 3 討論 靈芝多糖是靈芝的主要有效成分之一，我們用水提、醇沉法提取靈芝多糖，并經(jīng)透析除去分子量1萬(wàn)以下的成分，得到靈芝多糖粗品。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：靈芝多糖具有抗腫瘤、抗血栓及抗凝血的作用。本所實(shí)驗(yàn)證明GLPS對(duì)試管培養(yǎng)的癌細(xì)胞無(wú)直接殺傷作用，故靈芝多糖抗腫瘤作用可能是通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫功能而實(shí)現(xiàn)的［8～10］。靈芝多糖能降低纖維蛋白原含量，減弱部分凝血活酶的活性使其影響內(nèi)源性凝血途徑，并能抗血栓和抗凝血，其機(jī)理尚待探討。參考文獻(xiàn)［1］何云慶等，靈芝扶正固本有效成分靈芝多糖的化學(xué)研究 北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 1989；21（3）：225～227［2］Dubois M，et al：colarmetric method for defermination of sugars and related substances，Anal Chem，1956，28：350～352［3］方積年：多糖的分離純化及其純度鑒別與分子量測(cè)定 藥學(xué)通報(bào) 1984；19（1）：622～625［4］潘啟超等：腫瘤藥理學(xué)及化學(xué)治療學(xué)，廣州，廣東高等教育出版社，1989；［5］李連達(dá)：抗癌中藥的藥效學(xué)研究技術(shù)要求 中藥新藥與臨床藥理 1992；392）：6［6］徐叔云等主編：藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，第二版，北京，人民衛(wèi)生出版社，1991；1991；481［7］陳奇主編：中藥藥理研究方法學(xué)，第一版，北京，人民衛(wèi)生出版社，1991；481［8］雷林生等：靈芝多糖對(duì)抗環(huán)孢霉A、氫化可的松及抗腫瘤藥的免疫抑制作用 中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志 1993；7：183［9］雷林生等：靈芝多糖對(duì)老年小鼠脾細(xì)胞DNA多聚酶a活性及免疫功能的影響 藥學(xué)學(xué)報(bào) 1993；28（2）：577～582［10］曹容華等：靈芝多糖抗腫瘤作用的機(jī)理研究 山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 1992；30（3）：203～206